Gráfica de Lineweaver-Burk

Un exemplo de gráfica de Lineweaver–Burk de 1/v fronte a 1/a

En bioquímica, a gráfica de Lineweaver–Burk, representación de Lineweaver-Burk ou gráfica da dobre recíproca é unha representación gráfica da cinética encimática que presentan os encimas que seguen a ecuación de Michaelis–Menten, que foi descrita por Hans Lineweaver e Dean Burk en 1934. É unha gráfica liñal en lugar dunha curva.

A gráfica da dobre recíproca distorsiona a estrutura dos erros dos datos, e non é, polo tanto, a ferramenta máis axeitada para a determinación dos parámetros da cinética encimática. Aínda que a gráfica de Lineweaver–Burk foi utilizada historicamente para a avaliación dos parámetros da ecuación de Michaelis–Menten, xunto coas formas liñais alternativas de representar os datos, como a gráfica de Hanes–Woolf ou a de Eadie–Hofstee, todas as formas linearizadas da ecuación de Michaelis–Menten deberían evitarse para calcular os parámetros cinéticos. Os métodos de regresión non liñal debidanmente ponderados son significativamente máis exactos e agora son doadamente accesibles coa dispoñibilidade universal dos computadores de escritorio.

Definicións

A representación de Lineweaver–Burk deriva da transformación da ecuación de Michaelis–Menten,

$v=\frac{Va}{K_{\mathrm{m}}+a}$

na cal a velocidade $v$ é unha función da concentración de substrato $a$ e de dous parámetros: $V$, a velocidade limitante e $K_{\mathrm{m}}$, a constante de Michaelis. Tomando as recíprocas en ambos os membros da ecuación queda así:

$\frac{1}{v}=\frac{1}{V}+\frac{K_{\mathrm{m}}}{V}\cdot \frac{1}{a}$

Así a gráfica de $1/v$ fronte a $1/a$ xera unha liña recta que corta o eixe de ordenadas en $1/V$, e o de abscisas en $-1/K_{\mathrm{m}}$ e ten unha pendente de $K_{\mathrm{m}}/V$.

Aplicacións

Representación da dobre recíproca en diferentes tipos de inhibición.

Cando se usa para determinar o tipo de inhibición encimática, a representación de Lineweaver–Burk pode distinguir entre inhibidores competitivos, non-competitivos puros, incompetitivos (ou acompetitivos) e mixtos. Os diversos modos de inhibición poden compararse coa reacción non inhibida.

Inhibición competitiva

O valor aparente de $V$ non é afectado polos inhibidores competitivos. Polo tanto, os inhibidores competitivos teñen o mesmo punto de corte no eixe de ordenadas que os encimas non inhibidos.

A inhibición competitiva incrementa o valor aparente de $K_{\mathrm{m}}$, ou diminúe a afinidade do substrato. Graficamente, isto pode verse como que o encima inhibido ten un punto de corte na abscisa nun valor maior.

Inhibición non-competitiva pura

Na inhibición non-competitiva pura o valor aparente de $V$ diminúe. Isto pode verse na gráfica de Lineweaver–Burk como un punto de corte en ordenadas de maior valor, pero non ten ningún efecto no punto de corte en abscisas $-1/K_{\mathrm{m}}$, xa que a inhibición non-competitiva pura non afecta a afinidade do substrato.

Inhibición mixta

A inhibición non-competitiva pura é rara, mentres que a inhibición mixta é moito máis común. Na inhibición mixta o valor aparente de $V$ diminúe, e o de $K_{\mathrm{m}}$ cambia, xeralmente aumentando, o que significa que a afinidade adoita diminuír na inhibición mixta.

Cleland recoñeceu que a inhibición non-competitiva era moi rara na práctica, e aparecía principalmente cos efectos de protóns e algúns ións metálicos, e redefiniu non-competitiva para que significase mixta. Porén, aínda que moitos autores aceptaron este cambio, non todos o fixeron.

Inhibición incompetitiva

O valor aparente de $V$ diminúe na inhibición incompetitiva (tamén chamada acompetitiva), co de $V/K_{\mathrm{m}}$. Isto pode verse na gráfica de Lineweaver–Burk como un incremento do valor do punto de corte en ordenadas, sen cambio na pendente (orixínanse liñas paralelas).

A afinidade do substrato increméntase coa inhibición incompetitiva, ou diminúe o valor aparente de $K_{\mathrm{m}}$. Graficamente, a inhibición incompetitiva pode identificarse porque están representadas liñas parlelas para as diferentes concentracións de inhibidor.

Limitacións

A representación de Lineweaver–Burk non fai un bo traballo á hora de visualizar os erros experimentais. Concretamente, se os erros $\epsilon (v)$ teñen erros estándar uniformes, entón os de $1/v$ varían nun moi amplo rango, como se pode ver no seguinte exemplo:

Se $v=1\pm 0,1$ entón o rango de $1/v$ é 0,91–1,11, aproximadamente o 20 %.

Se $v=10\pm 0,1$ (mesma desviación estándar) entón o rango de $1/v$ é 0,0990–0,1001, aproximadamente o 1 %.

Lineweaver e Burk eran conscientes deste problema e despois de investigaren o ero de distribución experimentalmente, atopando unha desviación estándar uniforme en $v$, eles consultaron o eminente estatístico W. Edwards Deming. Á luz do seu consello, utilizaron ponderacións de $v^4$ para axustaren a súa $1/v$. Este aspecto do artigo que publicaron non sempre se ten en conta cando se explica o "método de Lineweaver e Burk."

Os valores medidos a unha baixa $a$, e, polo tanto, os valores grandes de $1/a$ orixinan puntos situados moi á dereita na gráfica e teñen un grande efecto sobre a pendente da liña, e así, en particular, sobre o valor de $K_{\mathrm{m}}$.

Véxase tamén

Outros artigos

• Cinética de Michaelis–Menten
• Gráfica de Eadie–Hofstee
• Gráfica de Hanes–Woolf
• Gráfica liñal directa

Ligazóns externas

• Guia dos NIH, desenvolvemento de ensaios de encimas e análises